A traditional medicine, respiratory detox shot (RDS), inhibits the infection of SARS-CoV, SARS-CoV-2, and the influenza A virus in vitro
Brian Hetrick1, Dongyang Yu2, Adeyemi A. Olanrewaju1, Linda D. Chilin1, Sijia He1, Deemah Dabbagh1,Ghaliah Alluhaibi1, Yuan - Chun Ma3, Lewis A. Hofmann4, Ramin M. Hakami1 and Yuntao Wu1*
▋摘要
着重：目前正侵扰世界各地的新型乙型患 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国家和沿海地区大流行，截至 2021 年 4 同月已导致大约 1.28 亿人感染者，大约 280 上千人丧命。当前，已确定可适当减缓 COVID-19 无故率的化疗方的单。我们分析了一种传统习俗的当中医抗生素制剂——融肺毒抗生素液 (RDS) 的潜在防乙型活病态，该抗生素液主要掺入为----现代医学传统习俗当中常用化疗肺部结核患的当中医。
结果：RDS 诱导 SARS-CoV 较慢患毒、SARS-CoV-2 较慢患毒、混和乙型患毒-SARS-CoV-2(Ha-CoV-2) 假型患毒以及传染病态 SARS-CoV-2 和衍生的 Ha-CoV-2 品系患毒 (B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429、B.1.2、B.1.494、B.1.1.207、B.1.258 和 B.1.1.298) 对靶巨噬细胞的感染者。我们再进一步毫无疑问 RDS 可以如此一来灭活 SARS-CoV-2 患毒外层的传染病态。此外，我们辨认出 RDS 还可阻塞乙型SARS患毒对靶巨噬细胞的感染者。
论证：RDS 可广泛应用诱导吞咽道患毒感染者。关键词：SARS-CoV-2，COVID-19，乙型，HIV化疗，融肺毒抗生素液，传统习俗当中医，SARS-CoV，乙型SARS，Ha-CoV-2，SARS-CoV-2 假型患毒
▋着重
目前正侵扰世界各地的新型乙型患 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国家和沿海地区大流行，截至 2021 年 4 同月已导致大约 1.28 亿人感染者，大约 280 上千人丧命。当前，已确定可适当减缓 COVID-19 无故率的化疗方的单。新出现的 COVID-19 患毒患原体为乙型 SARS-CoV-2[1]，是 SARS-CoV 在严重急病态吞咽综合征特别乙型多样当中的表兄弟患毒[2,3]。SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 在此之前都是在当中国人辨认出的；SARS-CoV 患毒于 2002 年 11 同月在佛山市首次被辨认出[4-6]，SARS-CoV-2 则于 2019 年 12 同月在武汉首次被辨认出[1,7,8]。在当中国人，这两次由乙型惹来的鼠疫当中，当中医之外被广泛应用应常用，用以紧急应付乙型惹来的结核患。对于当前的 COVID-19 大流行，当中国人有大约 85% 的 SARS-CoV-2 感染者病症不能接受了传统习俗当中医药药物（9，10）。许多应常用的当中医是否具适当的防乙型特病态并在临床上是否适当，这个重要问题尚未得到充分答复。
当中医作为化疗乙型所掀起结核患的适当药物，但由于缺乏人体内或灌注的系统分析，其发展与理论上应常用之外受到了促使。为了明确当中医的潜在防 SARS-CoV-2 活病态，我们从常用当中医当中比对了多种肉桂甜菜，并从当中医抗生素液 RDS(宾夕法尼亚州一种商业病态肉类本品) 当中辨认出了防 SARS-CoV 和防 SARS-CoV-2 患毒的活病态，一种在宾夕法尼亚州的商业肉类本品。RDS 常用増强人体循环系统的整体而言健康，其包包涵多种肉桂掺入，如人参和荆芥，它们是传统习俗上常用控制炎症和肺部结核患的当中医 (11-13)。在此，我们报道 RDS 对 SARS-CoV、SARS-CoV-2 假患毒以及具感染者病态的野生型 SARS-CoV-2 患毒对靶巨噬细胞的感染者具诱导主导作用。我们再进一步证明 RDS 可通过如此一来灭活患毒外层或阻扰患毒侵入而诱导患毒的早期感染者工程进度。此外，我们辨认出 RDS 还可以阻扰及第流患毒对靶巨噬细胞的感染者。这些相比之下，RDS 对吞咽道患毒的感染者有可能具广泛应用的诱导主导作用。
▋结果
为了从传统习俗当中医当中找到潜在的防 SARS-CoV-2 活病态，我们从约四十种传统习俗肉桂当中比对提取出 SARS-CoV-2S 防原假型较慢患毒[14,15] 和人体肺部 A549(ACE2) 靶巨噬细胞，此本能 ACE2 基因会通过较慢患毒转导作为多肽抑制，从而稳定转导来实现极限暗示。较慢假型患毒应常用绿色荧光防原 (GFP) 或荧光芝酶 (Luc) 作为报道基因，并通过了具广谱HIV进入诱导剂，以及曼尼多尔 (Arbidol)[16]，和本能防毒血清反防 SARS-CoV-2(左图 1a、C) 的验证。我们必须成功探测到曼尼多尔 (Arbidol) 和防毒血清对于 SARS-CoV-2 假型患毒的诱导主导作用，这是我们在其他四十余种传统习俗肉桂甜菜测试当中当中没有人辨认出的，有数其当中一些依赖于更高毒病态的肉桂 (左图 1a-C)。然而，鉴于较慢病态假型患毒仅有能探测 SARS-CoV-2 患毒的侵入使用暴力，我们不能回避这些肉桂甜菜有可能有在进入后阶段必须诱导 SARS-CoV-2 的有可能病态。我们再进一步从传统习俗抗生素融肺毒抗生素液 (RDS) 当中比对出了有可能的防 SARS-CoV-2 活病态，该新产品掺入另有肉桂掺入——、黄连、人参、荆芥、玄参、苦杏仁、蜂房、皂角、胭脂，在当中国人传统习俗上常用化疗肺部结核患 (11-13)。
掺入羧酸咖啡硫、3，4-二邻咖啡酰基奎宁硫、羧酸 3，4-二邻咖啡酰基奎宁硫、原儿茶硫、羧酸绿原硫和木犀草芝；花蕾当中还掺入糖类 A、B 和 10 种据信环内酯醚萜糖类[17]；该植物学还掺入皂香茅香茅 A 和 B，以及防炎症主导作用的糖类 C[18,19]。黄连酰胺糖类当中掺入木脂芝、松脂酰黄连糖类[20]。人参当中掺入被称为人参皂糖类的甾体皂糖类，是人参属植物学独有的植物学有毒[21,22]。细叶荆芥当中主要活病态掺入为四种单萜，(−)-薄荷酮、(+)-普博梅斯酮、(−)-柠檬内酯和 (+)-薄荷呋喃；这种植物学还掺入其他硫，如 1-辛内酯-3-醇和、3-辛酮、β-同刺柏内酯和β-石竹内酯[23]。玄参掺入大约 162 种硫，有数环内酯醚萜和环内酯醚萜糖类、苯丙糖类、有机硫、萜类、糖类、黄酮类、和皂糖类[24]。苦杏仁当中掺入类似物、氰基硫和果胶水溶性[25]。皂角刺当中掺入皂糖类和羽扇豆硫[26,27]，而胭脂当中掺入主要活病态掺入胭脂硫[28]。为了再进一步测试当中 RDS 的防 SARS-CoV-2 活病态，用相同提炼沸点的 RDS 后解决问题 A549(ACE2) 巨噬细胞，然后让这些巨噬细胞在依赖于 RDS 的意味着不能接受 4-6 星期的感染者。感染者后，在不依赖于 RDS 的意味着培育巨噬细胞，然后在 48 和 72 星期的时候，通过流的单巨噬细胞拳法对患毒感染者的诱导主导作用顺利进行分析方的单。为了控制巨噬细胞毒病态，应常用铋丙啶 (PI) 对即将丧命和已丧命的巨噬细胞顺利进行切片，仅有在活巨噬细胞群当中分析方的单 GFP+巨噬细胞。如左图 2 简述，我们推论到 RDS 对 SARS-CoV-2(GFP) 假患毒具低剂量依赖病态病态诱导主导作用。为了声称这些结果，我们应常用内源病态暗示 ACE2 的 VeroE6 巨噬细胞单调了该感染者实验。
(唯下页左图)
ACE2 之外暗示，生产病态 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 患毒可对其顺利进行感染者，ACE2 通常常用乙型的分析 (7)。考虑到在缺乏 ACE2 极限暗示 [15，29，30] 的意味着，假型患毒对 VeroE6 的感染者病态较低，我们还应常用了荧光芝酶报道基因假型患毒，该患毒的报道特异病态由 HIV-1LTR 和 Tat 马和达，具更高的报道基因敏感病态和信噪比。
左图 2：RDS 诱导 SARS-CoV-2(GFP) 假型患毒感染者 A549(ACE2) 巨噬细胞。
A.A549(ACE2) 巨噬细胞用 RDS 年终提炼 30 分钟后，用 SARS-CoV-2(GFP) 假型患毒感染者。将巨噬细胞洗脚去患毒和 RDS，并在不依赖于 RDS 的意味着顺利进行培育。流的单巨噬细胞明为探测患毒感染者诱导情况。未感染者的巨噬细胞和感染者 SARS-CoV-2(GFP) 但而无须 RDS 化疗的巨噬细胞作为比对。GFP+巨噬细胞百分比已推断。(PI) 铋丙啶。
B.RDS 的巨噬细胞毒病态一原理。A549(ACE2) 巨噬细胞用 RDS 年终提炼 4 星期，洗脚去 RDS，无 RDS 培育 48 星期。铋丙啶切片鉴定正在丧命巨噬细胞和已丧命巨噬细胞，流的单巨噬细胞拳法分析方的单。绘出低剂量-质子化巨噬细胞毒病态椭圆，RDS 的半无故沸点 (LC50) 百分比为 1:11.9。
如左图 3A 简述，我们应常用 Luc 报告基因假患毒和 VeroE6 巨噬细胞顺利进行感染者实验，推论到 RDS 对该患毒感染者具低剂量依赖病态病态诱导主导作用，并且有约诱导沸点明确为 1:230RDS 提炼度 (左图 3B)。我们还分析方的单了 RDS 对 VeroE6 巨噬细胞活力的冲击，明确了 50% 巨噬细胞丧命低剂量为 1:11.8RDS 提炼度。
左图 3：RDS 对 SARS-CoV-2(Luc) 假患毒和野生型 SARS-CoV-2 患毒的低剂量依赖病态病态诱导诱导主导作用。用 RDS 年终提炼后解决问题 A、BVeroE6 巨噬细胞，后用 SARS-CoV-2(Luc) 假型患毒感染者。将巨噬细胞洗脚去患毒和 RDS，并在不依赖于 RDS 的意味着顺利进行培育。在感染者后 72 星期用荧光芝酶探测患毒感染者的诱导主导作用。未感染者巨噬细胞和 SARS-CoV-2-luc 感染者但而无须过 RDS 化疗的巨噬细胞作为比对。实验单调三次。绘出低剂量质子化椭圆和 RDS 的 I-C50 提炼百分比为 1:230。CRDS 对 VeroE6 巨噬细胞的巨噬细胞毒病态也通过铋丙啶切片和流的单巨噬细胞拳法一原理。用 RDS 年终提炼 4 星期，洗脚去 RDS，在不包涵 RDS 的意味着培育 72 星期。绘出巨噬细胞毒病态低剂量-质子化椭圆，RDS 的半无故沸点 (LC50) 百分比为 1:13.8 提炼。DRDS 诱导传染病态 SARS-CoV-2 感染者。用年终提炼的 RDS 后解决问题 VeroE6 巨噬细胞，并在 RDS 依赖于的意味着感染者 SARS-CoV-2。感染者 48 星期后，通过噬菌斑分析方的单患毒释放后的患毒复制诱导情况。诱导测试一的单一整顺利进行，并在 Prism7(Graph Pad) 当中应常用单向方差 (One-Way ANOVA) 分析方的单及 Dunnett 后鉴定 (Dunnett's Post Test)，便是明确统计显着病态。总体病态值用星号坚称如下：*p
为了再进一步验证应常用假患毒拿到的结果，我们测试当中了 RDS 对于 SARS-CoV-2 感染者的阻塞传染病态能够。如左图 3D 简述，RDS 同时也阻塞了 SARS-CoV-2 对 VeroE6 巨噬细胞的感染者。RDS 在提炼 1:40 以上时可总体减少患毒斑点的形成。
综上，通过 SARS-CoV-2 假患毒与传染病态患毒的相比之下，RDS 掺入诱导 SARS-CoV-2 感染者的活病态掺入，有可能是通过如此一来灭活患毒或阻塞患毒的早期感染者工程进度。
为再进一步分析有可能的功能，我们将传染病态 SARS-CoV-2 患毒外层与年终提炼的 RDS 在 37°C 下预培育 1 星期。随后，将混和物再进一步依次提炼-(10–1 至 10–4)，并转到 Vero 巨噬细胞顺利进行噬菌斑分析方的单以明确患毒感染者病态的减缓。如左图 4A 简述，我们推论到在 RDS 当中直至暴露一星期后的患毒外层，其 SARS-CoV-2 的感染者效价也长方形低剂量依赖病态病态下降。该结果声称了 RDS 可适当如此一来灭活 SARS-CoV-2 患毒外层的传染病态。
我们再进一步测试当中了 RDS 是否也能诱导 SARS-CoV-2 患毒品系的感染者。为此，我们来进行最近开发的混和及第患毒-SARS-CoV-2 假型患毒 (Ha-CoV-2)[31] 来复合出一两部 S 防原则有，有数荷兰则有 (B.1.1.7)，南非则有 (B.1.351)，巴西则有 (P.1)，内华达州则有 (B.1.429)，和其他几个新兴则有 (B.1.2，B.1.494，B.1.1.207B.1.258，B.1.1.298)。Ha-CoV-2(Luc) 和特别 S 防原相异体在 37°C 年终提炼 RDS 培育 1 星期。随后，用该混和物感染者 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 靶巨噬细胞。感染者后 12 星期，荧光芝酶测患毒感染者的诱导主导作用。如左图 4B 简述，我们还推论到了 RDS 对 Ha-CoV-2(Luc) 和所有 S 防原则有的低剂量依赖病态病态诱导。
我们还测试当中了 RDS 阻塞 SARS-CoV 感染者的能够，应常用比如说 SARS-CoV 突刺防原的 GFP 报道基因较慢患毒和[15] 实为低剂量。我们将人 A549(ACE2) 巨噬细胞用作靶巨噬细胞，将其用两部提炼的 RDS 后解决问题，然后用 SARS-CoV(GFP) 报告基因假患毒感染者 4-6 星期。感染者后在不包涵 RDS 的意味着培育巨噬细胞，流的单巨噬细胞拳法分析方的单探测其对患毒感染者的诱导主导作用。同样，应常用铋丙啶回避正在丧命与已丧命的巨噬细胞，仅有在活巨噬细胞群当中分析方的单 GFP+巨噬细胞。如左图 5A 简述，我们推论到 RDS 对 SARS-CoV(GFP) 假型患毒的诱导主导作用长方形低剂量依赖病态病态。我们再进一步声称了这些结果，并分析方的单了 RDS 抑制的诱导与 Luc 报道基因 SARS-CoV 假型患毒，SARSCoV(Luc)。我们推论到 RDS 对 SARS-CoV(Luc) 和的诱导主导作用长方形低剂量病态依赖病态，其半诱导沸点 (IC50) 为 1:70.88 提炼度 (左图 5B，C)。考虑到 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 都应常用 ACE2 感染者靶巨噬细胞，我们还测试当中了 RDS 的HIV活病态是否仅有针对与 ACE2 有相互主导作用的乙型。为此，我们探测了一种不特别的负链 RNA 患毒--乙型SARS患毒。它通过患毒血凝芝 (HA) 和巨噬细胞α-唾液硫来感染者靶巨噬细胞。为了复合出乙型SARS患毒，将暗示乙型SARS A/WSN/33(H1N1) 基因每个片段的 8 个多肽和一个 GFP-报道基因共约转染到 HEK293T 巨噬细胞当中。在 RDS 依赖于的意味着，搜罗患毒外层后常用感染者前提 MDCK 巨噬细胞。如左图 6A 简述，我们推论到 RDS 对乙型SARS患毒的诱导主导作用长方形低剂量依赖病态病态。RDS 在 1:40 和 1:80 提炼时可完全阻塞患毒感染者，在 1:160 提炼时则可部分诱导乙型SARS。RDS 对 MDCK 巨噬细胞的半无故沸点 (LC50) 经测为 1:18.5(左图 6B)。这些相比之下，RDS 的HIV活病态并非针对特定患毒，而有可能必须广泛应用诱导多种吞咽道患毒，如乙型和乙型SARS患毒。
▋讨论
在本报告当中，我们毫无疑问传统习俗抗生素融肺毒抗生素液 (RDS) 掺入广谱HIV活病态，可阻塞 SARS-CoV、SARSCoV-2 和乙型SARS患毒的感染者。虽然 RDS 必须诱导多种患毒，但其HIV活病态因患毒类型和毒株而异。例如，对 SARS-CoV 较慢假患毒的 I-C50 沸点为 1:7.9 提炼度，对 SARS-CoV-2 较慢假患毒的 I-C50 沸点为 1:230 提炼度。对于传染病态野生型 SARS-CoV-2 患毒，I-C50 为 1:40 提炼度，对乙型SARS，其 I-C50 为 1:250。RDS 对 Ha-CoV-2 及其品系有相同的诱导主导作用，IC50 参数从 1:70 到 1:2601 提炼度不等 (左图 4B)。
(唯下一页左图)
左图 4 RDS 对 SARS-CoV-2 和衍生的 Ha-CoV-2 品系具低剂量依赖病态病态灭活主导作用。ASARS-CoV-2 外层加在年终提炼的 RDS 在 37°C 下培育 1 星期。随后，将混和物再进一步年终提炼，并转到 Vero 巨噬细胞当中顺利进行噬菌斑分析方的单，以明确患毒感染者病态减缓。诱导测试一的单一整顺利进行，并在 Prism7(GraphPad) 当中应常用单向方差 (One-WayANOVA) 分析方的单和 Dunnett 后鉴定 (Dunnett'sPostTest) 便是明确统计显着病态。总体病态值用星号坚称如下：*p
BHa-CoV-2(Luc) 和特别 S 防原则有与年终提炼的 RDS 在 37°C 培育 1 星期后，用混和物感染者 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 靶巨噬细胞。感染者后 12 星期，荧光芝酶测患毒感染者的诱导主导作用。RDS 的 IC50 值的提炼度为 1:177(wt)，1:828(B.1.1.7)，1:124(B.1.351)，1:88(P.1)，1:134(B.1.1.207)，1:2601(B.1.1.298)，1:70(B.1.258)，1:362(B.1.429)，1:163(B.1.494)，1:137(B.1.2)。
我们再进一步毫无疑问 RDS 可以诱导乙型的早期感染者工程进度。虽然具体的HIV功能尚未清楚，但 RDS 可以通过如此一来灭活患毒外层或通过阻扰患毒侵入或阻塞患毒侵入后的早期工程进度来阻扰患毒感染者。在其他几种传统习俗当中医当中也辨认出了防 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的活病态。例如，一种常唯的传统习俗当中医——胭脂。
胭脂根当中已证明掺入胭脂硫芝，可诱导 SARS 患毒[32] 临床复合株的复制。此外，另一种可常用化疗吞咽道结核患的当中医——双黄连制剂，已推断出在灌注以低剂量依赖病态病态方的单诱导 SARS-CoV-23CL 防原酶 (3CLpro) 活病态。悬钩子糖类和悬钩子芝拟作为双黄连阻塞 3CLpro[33] 的适当掺入。
左图 5 RDS 诱导 SARS-CoV 假型患毒对 A549(ACE2) 巨噬细胞的感染者。用年终提炼的 RDS 后解决问题 A、B 巨噬细胞，用 SARS-CoV(GFP)(A) 或 SARSCoV(Luc)B 假型患毒感染者。将巨噬细胞清洗脚，去掉患毒和 RDS，在不依赖于 RDS 的意味着顺利进行培育。在感染者后 48 星期和 72 星期，通过流的单巨噬细胞拳法或荧光芝酶探测来一原理患毒感染者的诱导主导作用。实验单调三次。绘出低剂量响应椭圆，并绘出 RDS 的 IC50 值为 1:70.9 提炼度 (C)
左图 6 RDS 诱导及第流患毒对 MDCK 巨噬细胞的感染者。(A) 用年终提炼的 RDS 后解决问题 MDCK 巨噬细胞 30 分钟，然后用及第流患毒 (GFP) 对其顺利进行感染者。感染者后，在 RDS 依赖于下培育巨噬细胞。36 星期后用流的单巨噬细胞明为对患毒感染者的诱导主导作用顺利进行一原理。把未感染者的巨噬细胞与被及第流患毒 (GFP) 感染者但而无须 RDS 解决问题的巨噬细胞顺利进行对比。左图当中推断了 GFP+巨噬细胞的百分比。PI 坚称铋丙啶 PI。
(B) 另外还应常用了 MTT 测法一原理了 RDS 对 MDCK 巨噬细胞的毒病态，绘出了巨噬细胞毒病态的低剂量-质子化椭圆，经计算，RDS 的有约无故沸点为 1:18.5 提炼度 RDS 的适当HIV掺入尚未明确。然而，RDS 相同于悬钩子糖类和悬钩子芝，RDS 可以通过如此一来灭活患毒粒子来阻塞患毒感染者 (左图 4)，而悬钩子糖类和悬钩子芝则在患毒生命周期的后期通过阻塞患毒防原酶的活病态来无论如何。然而，RDS 的灌注防 SARS-CoV-2 活病态仍需在今后的食肉动物分析和本能临床测试当中得到声称。目前，我们正在顺利进行小型食肉动物实验，以明确 RDS 在人体内阻塞 SARS-CoV-2 患毒感染者的商业价值。
▋论证
我们的分析表明，RDS 可广泛应用诱导吞咽道患毒的感染者，如 SARS-CoV、SARS-CoV-2 和乙型SARS。
▋方的单
巨噬细胞和巨噬细胞培育
HEK293T (ATCC 塞拉格鲁，密西西比州) MDCK (ATCC 塞拉格鲁，密西西比州)，VeroE6 (ATCC 塞拉格鲁，密西西比州) 和 A549 (ACE2) (来自 Virongy LLC 赠送给，塞拉格鲁，密西西比州)，和 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) (来自 Virongy LLC 赠送给，塞拉格鲁，密西西比州) 目前遗留于 Dulbecco's modifiedEagle's medium (DMEM) (赛默飞世尔新技术 Thermo Fisher Scientific) 掺入 10% 热灭活 FBS 和 1×青霉芝-链霉芝 (赛默飞世尔新技术 Thermo Fisher Scientific)。在 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 巨噬细胞培育基当中分别以 1μg/ml 和 200μg/ml 的沸点转到嘌呤霉芝和潮霉芝 B。
位点转染和患毒复合出
包涵 SARS-CoVS 防原或 SARS-CoV-2S 防原的较慢病态假型患毒外层由 Virongy LLC (Manassas，VA) 透过，或按照上面详细描述的方的单[15] 复合出。简言之，为了复合出 GFP 报道基因较慢病态假患毒，HEK293T 巨噬细胞与暗示 SARS-CoVS 防原或 SARS-CoV-2S 防原的多肽、pCMVΔR8.2 和 pLKO.1-puro-TurboGFP 共约转染。为了存量荧光芝酶报道基因较慢病态假型患毒，将 HEK293T 巨噬细胞与暗示 SARSCoVS 防原或 SARS-CoV-2S 防原的多肽、pCMVΔR8.2 和 pLTR-Tat-IRES-Luc 顺利进行共约转染。转染后 48 星期搜罗患毒上清液，离心提炼，−80℃ 遗留。野生型 SARS-CoV-2 患毒 (Isolate USA-WA1/2020) 由 BEI Bioresources (Manassas，VA) 透过。pHW-NAGFP (ΔAT6) 报告基因位点和 A/WSN/1933 H1N1 衍生位点 pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-HA、pHW2000-NP、pHW2000-NA、pHW20000M 由 FengLi 指导教授友好透过。在SARS患毒 A-GFP 报道基因粒子复合出当中，将 pHW2000-pb2、pHW2000-pb1、pHW2000-PA、pHW2000-ha、pHW2000-np、pHW2000-na、pHW2000-m、pHW2000-ns 和 pHW-NA-GFP 共约转染 HEK293T 巨噬细胞 (ΔAT6)。48 星期后搜罗患毒上清液。SARS-CoV-2S、M、E、N 暗示多肽购自 Sinobiological。来进行 Twist Bioscience 合成了 Ha-CoV-2(Luc) 多肽和 S 防原相异多肽。Ha-CoV-2(Luc) 和 S 防原相异粒子按照上面详细描述方的单[31] 顺利进行复合出。
患毒感染者和抗生素诱导测试
RDS(融肺毒抗生素液)(来自 Dejia Harmony 赠送给，利斯堡，密西西比州) 是由马和指导教授实验室 (Burnaby，BC，Canada) 生产的一种商业新产品。RDS 当中所有当中医掺入之外符合《当中国人药典 2015 年版》「饮片」标准，有数适当掺入包涵量及重金属、农药限量探测。RDS 是一种当中医的共约水煮剂，事与愿违游离在真空条件下蒸发。SARS-CoV-2 防血清由 LanceA. Liotta 外科医生透过。将曼尼朵尔盐硫盐 (Sigma) 重新悬浮在二羧酸亚砜 (Sigma) 当中。对于假型患毒感染者，12 孔板当中的 A549(ACE2) 巨噬细胞 (来自 Virongy LLC 赠送给，塞拉格鲁，密西西比州) 或 VeroE6 巨噬细胞用 RDS 后解决问题 30 分钟，在 37℃ 下感染者 4-6 星期，然后在好吃培育基当中洗脚涤培育 48-72 星期。对于 VeroE6 巨噬细胞的感染者，巨噬细胞也被 CoV-2 假型患毒感染者増强剂 (CoV-2PIE) (来自 Virongy LLC 赠送给，塞拉格鲁，密西西比州) 后解决问题后，在 37°C 下再解决问题 30 分钟。应常用 GloMaxDiscover 酶标明为 (Promega) 分析方的单巨噬细胞裂解物的荧光芝酶活病态。对于野生型 SARS-CoV-2 感染者，VeroE6 巨噬细胞在 37°C 下用 RDS 后解决问题 30 分钟，然后用 MOI 为 0.05 感染者 SARS-CoV-2 (Isolate USA-WA1/2020；BEI Bioresources) 在詹姆斯奥利弗学院的 BSL-3 救助设施内停留 1 星期。巨噬细胞用 PBS 洗脚涤 2 次，用包涵 RDS 的培育基培育 48 星期。从上清当中提取患毒，用 12 孔板培育的 Vero 巨噬细胞单层当中的噬菌斑测试测小瓶滴度。简言之，每个材料在零碎的 Dul-becco's ModifiedEagle 培育基 (VWR) 当中复合出，包包涵 1X 青霉芝-链霉芝 (VWR)，并附加在 10% 的 FBS(赛默飞世尔新技术 Thermo Fisher Scientific)。然后将 200 微升的每种提炼液吸附到 VeroE6 巨噬细胞单层的三个垂直孔上 1 星期。然后用 1～2 ml0.6% 琼脂糖 (Invitrogen) 和一部分零碎的 Eagle Minimal Essential 培育基 (VWR) 的混和物延展单层，包涵 1X 青霉芝-链霉芝，并附加在 10%FBS。48 星期后，将单层膜一般而言在 10% 及第醛溶液当中 1 星期，并去除延展的琼脂塞。为了切片斑点，转到掺入 20% 乙醇和的 1% 气态紫涂料溶液 5 分钟，然后用去离子水洗脚涤。对于乙型SARS患毒感染者 MDCK 巨噬细胞，在 37°C 下用 RDS 后解决问题 30 分钟，然后用 A-GFP 报道基因患毒感染者 6 星期。用包涵 RDS 的培育基洗脚涤巨噬细胞，培育 36 星期。GFP 暗示通过流的单巨噬细胞明为一原理。(FACSCalibur，BD Biosciences).
对于 SARS-CoV-2 患毒外层的 RDS 灭活测试，将 100μl 年终提炼的 RDS 附加在到 1 mlSARS-CoV-2 患毒原液 (3.65×105PFU/ml) 当中，事与愿违 RDS 提炼为 1:20，1:40 或 1:80。也有数比对条件 (1 ml 患毒+100μl 培育基)。混和物在 37°C 下培育 1 星期。随后，对混和物顺利进行两部提炼以造成额外的 1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000 提炼度，并将年终提炼的材料转到 12 孔板当中的 Vero 巨噬细胞当中，常用顺利进行噬菌斑测分析方的单。斑点测当中事与愿违的 RDS 提炼度为 1:200 至 1:200,000；1:400 到 1:400,000；和 1:800 到 1:800,000 的 RDS 提炼液。
Ha-CoV-2(Luc) 和 S 防原相异粒子按照上面详细描述的方的单[31] 复合出。对于 Ha-CoV-2(Luc) 的 RDS 灭活，将 5μl 年终提炼的 RDS 附加在到 45μlHa-CoV-2(Luc) 或则有当中，事与愿违 RDS 提炼度为 1:20、1:40、1:80、1:160 或 1:320。将混和物在 37°C 下培育 1 星期，然后在 RDS 依赖于下感染者 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 巨噬细胞 12 星期。应常用 GloMax Discover 酶标明为 (Promega) 分析方的单巨噬细胞裂解物的荧光芝酶活病态。
巨噬细胞毒病态分析方的单探测
用铋丙啶切片和流的单巨噬细胞拳法分析方的单对 A549 (ACE2) 巨噬细胞和 VeroE6 巨噬细胞的抗生素巨噬细胞毒病态顺利进行探测，如所述 (34)。应常用巨噬细胞増殖溶剂盒 I(MTT) (Sigma) 和制造商敦促的方案对 MDCK 巨噬细胞的抗生素毒病态顺利进行分析方的单。简言之，将 MDCK 巨噬细胞 (ATCC) 以每孔 1×-105 个巨噬细胞的平之外速度疫苗到 12 孔板当中。巨噬细胞培育隔夜后，通过 RDS 解决问题 1 天，然后在 MTT 标记溶剂 (Sigma) 的培育基当中培育。将巨噬细胞与标记溶剂共约同培育 4 星期，再更再进一步转到 MTT 増溶液。培育皿孵育过夜，用 GloMax Discover 酶标明为 (Promega) 测吸光度。
缩写
SARS-CoV：严重急病态循环系统综合征特别乙型；SARSCoV-2：Severe 严重急病态循环系统综合征特别乙型-2；TCM：传统习俗当中医；RDS：吞咽道持续性抗生素液；Ha-CoV-2：混和乙型新冠患毒假患毒。
致谢
非常感谢 FengLi 透过SARS患毒暗示多肽，非常感谢 LanceLiotta 透过防毒血清；非常感谢 TedCi，HeSun，ZhigangGao，WanyingWu 的讨论与敦促；非常感谢 KevinCarter、MarkMamdar、RichKeurajian、KarenFreidouni 透过 RDS 和肉桂甜菜。
所写贡献
此次实验由 Y.W.，R.H. 和 L.A.H. 新设计，由 Y.W. 出版人，由 L.A.H. 主笔。B.H.，D.Y.，A.A.O.，L.D.C.，S.H.，D.D、GA 及 YM 执行了该实验。所有所写已阅读并批准后事与愿违稿件。
资金来源
本分析的经费来自于詹姆斯奥利弗学院之外款项 223741(DeJiaHarmony/Anti-SARS-CoV-2)，该款项由德佳和畅 (DeJiaHarmony) 透过。
数据资料和金属材料的可用病态
本分析当中造成或分析方的单的所有数据资料之外包包涵在本文当中。溶剂可从 Y.W 处获取。
声明
批准后及参与同意
不等同于
同意出版
不等同于
竞争利益
詹姆斯奥利弗学院国家生物防守和传染患当一个中心的 RMH 和 YW 已拿到了德佳和畅 (DejiaHarmony) 的分析资助，LAH 为德佳和畅兼顾问并拿到了酬金。没有人其他关系或社区活动有可能会冲击到提交的工作。
所写请注意
1宾夕法尼亚州密西西比州詹姆斯奥利弗学院计算机科学该学院国家生物防守和传染患当一个中心，塞拉格鲁 20110。
2VirongyLLC，密西西比州塞拉格鲁。3加在拿大叔纳比，BCV5J0E5 马和指导教授实验室 (Dr.Ma's LaboratoriesInc.)。4 宾夕法尼亚州密西西比州利斯堡世界卫生科学组织，20176。
收稿月份：2021 年 4 同月 7 日
不能接受月份：2021 年 5 同月 10 日
线上出版星期：2021 年 5 同月 29 日
以下内容
1. Zhu N, Zhang D, Wang W, Li X, Yang B, Song J, et al. A Novel Coronirus from Patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 2020;382(8):727–33.
2. Wu Y, Ho W, Huang Y, Jin D, Li S, Liu S, et al. SARS-CoV-2 is an appropriate name for the new coronirus. Lancet. 2020;395(10228):949–50.
3. Gorbalenya AE, Baker SC, Baric RS, de Groot RJ, Drosten C, Gulyaeva AA, et al. Coroniridae Study Group of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Nat Microbiol. 2020;5:536–44.
4. Drosten C, Günther S, Preiser W, van der Werf S, Brodt H-R, Becker S, et al. Identification of a novel coronirus in patients with severe acute respiratory syndrome. N Engl J Med. 2003;348(20):1967–76.
5. Ksiazek TG, Erdman D, Goldsmith CS, Zaki SR, Peret T, Emery S, et al. A novel coronirus associated with severe acute respiratory syndrome. N Engl J Med. 2003;348(20):1953–66.
6. Peiris JSM, Lai ST, Poon LLM, Guan Y, Yam LYC, Lim W, et al. Coronirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome. Lancet. 2003;361(9366):1319–25.
7. Zhou P, Yang X-L, Wang X-G, Hu B, Zhang L, Zhang W, et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronirus of probable bat origin. Nature. 2020;579(7798):270–3.
8. Wu F, Zhao S, Yu B, Chen Y-M, Wang W, Song Z-G, et al. A new coronirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 2020;579(7798):265–9.
9. Yang Y, Islam MS, Wang J, Li Y, Chen X. Traditional Chinese medicine in the treatment of patients infected with 2019-new coronirus (SARS-CoV-2): a review and perspective. Int J Biol Sci. 2020;16(10):1708–17.
10. Ling CQ. Traditional Chinese medicine is a resource for drug discovery against 2019 novel coronirus (SARS-CoV-2). Journal Integr Medicine. 2020;18(2):87–8.
11. Shan M-Q, Qian Y, Yu S, Guo S-C, Zhang L, Ding A-W, et al. Anti-inflammatory effect of volatile oil from Schizonepeta tenuifolia on carrageenininduced pleurisy in rats and its application to study of appropriate harvesting time coupled with multi-attribute comprehensive index method. J Ethnopharmacol. 2016;194:580–6.
12. Jung ID, Kim HY, Park JW, Lee CM, Noh KT, Kang HK, et al. RG-II from Panax ginseng C.A. Meyer suppresses asthmatic reaction. BMB Reports. 2012;45(2):79–84.
13. Wu W, Li R, Li X, He J, Jiang S, Liu S, et al. Quercetin as an antiviral agent inhibits influenza A virus (IAV) entry. Viruses. 2015;8(1):6. doi. org/
10. 3390/ v8010 006. 14. Belouzard S, Chu VC, Whittaker GR. Activation of the SARS coronirus spike protein via sequential proteolytic cleage at two distinct sites. Proc Natl Acad Sci USA. 2009;106(14):5871–6.
15. He S, Waheed AA, Hetrick B, Dabbagh D, Akhrymuk IV, Kehn-Hall K, et al. PSGL-1 inhibits the incorporation of SARS-CoV and SARS-CoV-2 spike glycoproteins into pseudovirus and impairs pseudovirus attachment and infectivity. Viruses. 2021;13(1):46. doi. org/ 10. 3390/ v1301 0046.
16. Boriskin YS, Leneva IA, Pecheur EI, Polyak SJ. Arbidol: a broad-spectrum antiviral compound that blocks viral fusion. Curr Med Chem. 2008;15(10):997–1005.
17. Kakuda R, Imai M, Yaoita Y, Machida K, Kikuchi M. Secoiridoid glycosides from the flower buds of Lonicera japonica. Phytochemistry. 2000;55(8):879–81.
18. Son KH, Jung KY, Chang HW, Kim HP, Kang SS. Triterpenoid saponins from the aerial parts of Lonicera japonica. Phytochemistry. 1994;35(4):1005–8.
19. Kwak WJ, Han CK, Chang HW, Kim HP, Kang SS, Son KH. Loniceroside C, an antiinflammatory saponin from Lonicera japonica. Chem Pharm Bull. 2003;51(3):333–5.
20. Din LB, Bedgar DL, Katayama T, Lewis NG. On the stereoselective synthesis of (+)-pinoresinol in Forsythia suspensa from its achiral precursor, coniferyl alcohol. Phytochemistry. 1992;31(11):3869–74.
21. Kim YS, Woo JY, Han CK, Chang IM. Safety ysis of panax ginseng in randomized clinical trials: a systematic review. Medicines. 2015;2(2):106–26.
22. Attele AS, Wu JA, Yuan CS. Ginseng pharmacology: multiple constituents and multiple actions. Biochem Pharmacol. 1999;58(11):1685–93.
23. Yu S, Chen Y, Zhang L, Shan M, Tang Y, Ding A. Quantitative comparative ysis of the bio-active and toxic constituents of lees and spikes of Schizonepeta tenuifolia at different harvesting times. Int J Mol Sci. 2011;12(10):6635–44.
24. Ren D, Shen Z-y, Qin L-p, Zhu B. Pharmacology, phytochemistry, and traditional uses of Scrophularia ningpoensis Hemsl. J Ethnopharmacol. 2021;269:113688.
25. Sefer F, Misirli A, Gülcan R, editors. A RESEARCH ON PHENOLIC AND CYANOGENIC COMPOUNDS IN SWEET AND BITTER KERNELLED APRICOT VARIETIES. 2006: International Society for Horticultural Science (ISHS), Leuven, Belgium.
26. Chong W, Feng XY, Zhen GZ, Dan L, Yue D. Inhibition of mast cell degranulation by saponins from Gleditsia sinensis–structure-activity relationships. Nat Prod Commun. 2009;4(6):777–82.
27. Li WH, Zhang XM, Tian RR, Zheng YT, Zhao WM, Qiu MH. A new anti-HIV lupane acid from Gleditsia sinensis Lam. J Asian Nat Prod Res. 2007;9(6–8):551–5.
28. Nazari S, Rameshrad M, Hosseinzadeh H. Toxicological effects of Glycyrrhiza glabra (Licorice): a review. Phytother Res. 2017;31(11):1635–50.
29. Meltzer B, Dabbagh D, Guo J, Kashanchi F, Tyagi M, Wu Y. Tat controls transcriptional persistence of unintegrated HIV genome in primary human macrophages. Virology. 2018;518:241–52.
30. Wang Z, Tang Z, Zheng Y, Yu D, Spear M, Iyer SR, et al. Development of a nonintegrating Rev-dependent lentiviral vector carrying diphtheria toxin A chain and human TRAF6 to target HIV reservoirs. Gene Ther. 2010;17(9):1063–76.
31. Hetrick B, He S, Chilin LD, Dabbagh D, Alem F, Narayanan A, et al. Development of a novel hybrid alphirus-SARS-CoV-2 particle for rapid in vitro screening and quantification of neutralization antibodies, viral variants, and antiviral drugs. bioRxiv 2020. doi. org/ 10. 1101/ 2020. 12. 22. 423965.
32. Cinatl J, Morgenstern B, Bauer G, Chandra P, Rabenau H, Doerr HW. Glycyrrhizin, an active component of liquorice roots, and replication of SARS-associated coronirus. Lancet. 2003;361(9374):2045–6.
33. Su H-x, Yao S, Zhao W-f, Li M-j, Liu J, Shang W-j, et al. Anti-SARS-CoV-2 activities in vitro of Shuanghuanglian preparations and bioactive ingredients. Acta Pharmacologica Sinica. 2020;41(9):1167–77.
34. Crowley LC, Scott AP, Marfell BJ, Boughaba JA, Chojnowski G, Waterhouse NJ. Measuring cell death by Propidium Iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harb Protoc. 2016. doi. org/ 10. 1101/ pdb. prot0 87163.
主笔： 翟极限男相关新闻
相关问答
